一、實(shí)驗室網(wǎng)絡(luò )設置
實(shí)驗室網(wǎng)絡(luò )由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家流感中心和省級流感實(shí)驗室兩級組成。
二、實(shí)驗室條件及生物安全操作的要求
1.省級流感實(shí)驗室實(shí)驗條件及生物安全的操作要求
(1)實(shí)驗生物安全要求：安全Ⅱ級+(BSL-2級+)或安全Ⅲ級(BSL-3級)。
(2)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測、血清學(xué)檢測中用到的血凝抑制實(shí)驗(HI)可以在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實(shí)驗室里操作。
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實(shí)驗室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進(jìn)行病毒核酸檢測的實(shí)驗室要求請參照國家有關(guān)核酸檢測要求的規定。
(4)微量中和實(shí)驗、特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽(yáng)性的采樣標本的病毒分離、尸檢標本的檢測必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室里操作。
(5)省級流感實(shí)驗室實(shí)驗條件：具備進(jìn)行禽流感相關(guān)臨床標本初篩所需的生物安全柜、離心機、PCR儀、電泳儀、紫外線(xiàn)檢測儀等配套設備。
2.國家流感中心
實(shí)驗生物安全要求：生物安全Ⅱ級+(BSL-2級+)和生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室。
3.省級流感實(shí)驗室職責
(1)禽流感采樣標本的臨床標本特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測；
(2)禽流感H5的血清學(xué)檢測工作;
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽(yáng)性標本的病毒分離必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室；
(4)沒(méi)有生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室的，將標本送國家流感中心做病毒的分離工作。
4.國家流感中心實(shí)驗室職責
(1)國家流感中心設立在中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感室；
(2)對各省報告的禽流感疑似病例或確診病例進(jìn)行復核、確認；
(3)對不具備禽流感病毒分離條件的省份送檢標本的檢測、分離和確認；
(4)對需要做微量中和實(shí)驗的血清標本進(jìn)行微量中和試驗；
(5)對各省級實(shí)驗室檢測人員的培訓；
(6)對各省級流感實(shí)驗室的質(zhì)量控制。
三、原始標本采集
1.標本采集人員
醫療機構的醫生、護士或當地疾病預防控制中心專(zhuān)業(yè)人員負責標本采集并填寫(xiě)標本登記表，標本采集人員按照《禽流感職業(yè)暴露人員防護原則》做好個(gè)人防護。
2.標本采集種類(lèi)和時(shí)限
(1)采集標本的種類(lèi)：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
(2)采集標本時(shí)間：
1)咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；
2)急性期血清在發(fā)病后7天內采集，恢復期血清在發(fā)病后2-4周采集；
3)尸檢標本尸檢時(shí)采集。
3.標本的運送：所有采集的標本應在醫院采集時(shí)立即分裝，一式二份，其中一份單獨保存，以備復核。采集的標本若不能在24小時(shí)內送達，則應盡快在-70℃以下保存。無(wú)-70℃條件的需在-20℃冰箱短時(shí)間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標本。
4.標本采集的方法：詳見(jiàn)國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》
四、送流感中心的標本包裝、運送與接收
1.標本的包裝
(1)標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內有橡膠圈的塑料管里，擰緊。
(2)將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋內密封；每袋裝一份標本。
(3)直接在塑料管上用油性記號筆寫(xiě)明樣本的種類(lèi)、采樣時(shí)間、編號、姓名，同時(shí)也將標本有關(guān)信息填在禽流感人體標本送檢登記表，連同塑料管用另一塑料袋內密封。
(4)將裝標本的密封袋放入專(zhuān)用運輸箱內(或疫苗冷藏包)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一個(gè)塑料袋內再次做密封。若將進(jìn)行病毒分離，可將密封好的裝有標本的容器直接放入液氮運輸罐內運輸。所有容器必須印有生物危險標識。
2.標本運送
(1)航空或鐵路運送。
(2)專(zhuān)人專(zhuān)車(chē)運送：主要用于近距離樣品運送。
3.標本的接收
(1)各省級中心實(shí)驗室應公布標本接收聯(lián)系方式，并實(shí)行24小時(shí)標本接收制；
(2)國家實(shí)驗室標本接收：
需送國家流感中心實(shí)驗室檢測的原始標本、病毒分離物、可疑陽(yáng)性標本、血清等，填寫(xiě)標本送檢登記表，在低溫保存條件下，于24小時(shí)內送至中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感中心進(jìn)行復核。國家流感中心標本接收聯(lián)系方式為：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，地址：北京市宣武區迎新街100號，聯(lián)系人：郭元吉、王敏，聯(lián)系電話(huà)：010-63534632，010-63581337，傳真：(010)63534632。
五、標本檢測方法
1.禽H5病毒核酸檢測：
材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒的快速檢測、測序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取試劑盒、逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶等試劑,建議使用德國QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR產(chǎn)物純化)產(chǎn)品。2.病毒分離及鑒定：
材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：采用雞胚和MDCK細胞分離方法，血凝及血凝抑制試驗(HAI)具體方法詳見(jiàn)國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。經(jīng)特異性H5 RT-PCR病毒核酸檢測陽(yáng)性的采樣標本的病毒分離及鑒定工作必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室里操作。
試劑：雞胚接種采用SPF雞胚，MDCK細胞等。
3.疑似病例的血清學(xué)檢測：
材料：疑似病例的急性期和恢復期的雙份血清
方法：血凝抑制實(shí)驗具體方法詳見(jiàn)國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。
試劑：H5滅活病毒。
4.微量中和試驗
材料：疑似病例的急性期和恢復期的雙份血清
試劑：H5活病毒，必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實(shí)驗室里操作。
六、檢測結果的確認
以下情況的原始標本及分離物送國家流感中心檢測、復核、確認。
1.標本分離物血凝實(shí)驗(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5血凝抑制試驗(HI)陰性，H5的RT-PCR檢測陽(yáng)性。
2.標本分離物血凝實(shí)驗(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5血凝抑制試驗(HI)陽(yáng)性或H5的RT-PCR檢測陽(yáng)性。
3.標本分離物血凝實(shí)驗(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5的RT-PCR檢測陽(yáng)性。
4.病人恢復期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。
5.標本分離陽(yáng)性，H5血凝抑制試驗陰性，并已排除了是當前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、檢測結果報告
一般情況下,實(shí)驗室收到的樣本立即進(jìn)行實(shí)驗，并于收到標本后24小時(shí)內出具RT-PCR檢測報告，3-5天出具病毒分離培養結果，于分離到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制結果，微量中和實(shí)驗須3-5天完成。當實(shí)驗過(guò)程中出現不可預測情況或意外事件，影響了按時(shí)出具報告時(shí)，應及時(shí)報告和說(shuō)明。
